El Museo fue fundado por Juan VI, rey de Portugal, en 1818 bajo el nombre de Museo Real, con el propósito de fomentar la investigación científica en Brasil. Inicialmente ocupaba un predio ubicado en el Campo de Santana, en el centro de Río, y albergaba ejemplares botánicos y animales disecados, en especial aves, lo que hizo que fuera conocido como la Casa dos Pássaros.

Con el matrimonio del emperador Pedro I de Brasil, hijo del rey fundador, con la archiduquesa Leopoldina de Austria llegaron a Brasil algunos de los más importantes naturalistas del siglo XIX, como Johann Baptiste von Spix y Carl Friedrich Philipp von Martius, quienes trabajarían para el Museo. Otros investigadores europeos, como Auguste de Saint-Hilaire y el barón Georg Heinrich von Langsdorff, contribuirían a la colección de ejemplares botánicos del Museo Real, como resultado de sus expediciones por el país.

Durante el transcurso del siglo XIX, el Museo invirtió en las áreas de antropología, paleontología y arqueología. El propio emperador –un entusiasta de todas los ramas de la ciencia– contribuyó a su colección con diversas piezas de arte egipcio, fósiles y ejemplares botánicos. De esta forma se modernizó y se convirtió en el centro más importante de América del Sur en historia natural y ciencias humanas.

Tras la instauración de la República, el Palacio de São Cristóvão, residencia oficial de los emperadores, pasó a ser la sede del Museu Nacional. En 1946 pasó a ser administrado por la Universidad de Brasil, actualmente la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ). A pesar de su importancia, la institución había sufrido recortes financieros y llevaba tres años funcionando con un presupuesto reducido.